研究背景
已知肠道基质细胞可调节肠道干细胞的增殖和分化，但是，人们对这些多样的基质细胞群维持组织稳态和修复功能的精确细胞、分子机制却了解很少。
这里介绍了名为MAP3K2调节的肠道基质细胞(MRISCs)亚群，并揭示它们是小鼠肠损伤后WNT激动剂R-spondin1的主要细胞来源。在表观遗传学和转录组学上，MRISCs不同于先前报道的肠基质细胞亚群，能够起到维持LGR5+肠道干细胞的作用。研究表明，MRISCs是肠道干细胞微环境的关键组成部分，特异性依赖MAP3K2来增强WNT信号，从而再生受损的肠道。
方法流程
研究结果
01Map3k2通过维持肠道干细胞数量保护小鼠免受葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎侵害
肠道干细胞(ISC)依赖局部间充质基质细胞产生的特定信号和生长因子实现快速增殖和组织修复。MAP3K2是属于MAP3K超家族的丝氨酸/苏氨酸激酶。向野生型和Map3k2-/-小鼠饮用水中添加诱导结肠炎的葡聚糖硫酸钠(DSS)。与野生型小鼠相比，Map3k2-/-小鼠的疾病表型更为严重。此外，与Map3k2+/+Lgr5-EGFP-creERT2小鼠相比，DSS处理导致Map3k2-/-Lgr5-EGFP-creERT2小鼠干细胞表达的增强型绿色荧光蛋白标记LGR5(LGR5-EGFP)降低更多。表明了MAP3K2保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎侵害，并保持ISC数量。
Map3k2通过维持ISC数量保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎侵袭
02肠基质MAP3K2通过诱导Rspo1表达保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎侵害
为进一步揭示MAP3K2缺乏对肠道的影响，接下来分析了DSS处理的野生型和Map3k2-/-小鼠结肠转录组。基因集富集分析(GSEA)显示，DSS暴露后Map3k2-/-结肠中趋化因子基因上调，MAPK信号相关基因下调，并显示有WNT信号基因的显著下调。R-spondin1对于快速增强WNT信号及维持肠道完整性至关重要。DSS暴露后，Map3k2-/-结肠中Rspo1的表达下降，而Rspo3的表达则未下降。为了研究这种MAP3K2调控的Rspo1表达是否与ISC功能相关，检查了Rspo1在结肠中表达的位置：主要为上皮下层的基部。此外，这种空间特异性诱导在Map3k2-/-结肠中减弱，表明MAP3K2介导的Rspo1表达上调特异发生在结肠隐窝底部。
肠基质MAP3K2通过诱导Rspo1表达保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎侵害
03CD90medCD81+CD34+MRISCs通过增加R-spondin1的生成保护肠道干细胞
为了揭示DSS损伤肠道中Map3k2依赖的Rspo1表达的细胞来源，分选了肠上皮细胞(IEC)(CD+)、造血细胞(CD45+)和肠间充质基质细胞(GP38+)，再根据隐窝基质细胞标志CD90将GP38+细胞进一步分为CD90+和CD90-，评估Rspo1表达：CD90+GP38+基质细胞表达Rspo1和Map3k2水平高于其他结肠细胞，DSS处理后，CD90+GP38+基质细胞中Rspo1的表达显著上调，但Map3k2-/-CD90+GP38+基质细胞中Rspo1的表达减弱。在特异删除基质Map3k2的小鼠中，DSS诱导的结肠炎更为严重，并有Lgr5表达降低和Il6表达增加，表示Map3k2的保护作用具有基质特异性。由于结肠淋巴内皮细胞(LEC)也表达CD90，下文中将CD90+GP38+基质细胞称为“CD90中高”(CD90med)GP38+基质细胞。
为进一步表征CD90medGP38+基质细胞，使用单细胞测序平台对暴露于DSS的结肠固有层11,个CD90medGP38+基质细胞进行单细胞RNA测序，无监督聚类显示十个不同细胞簇。其中簇2、5和8高水平表达Rspo1，表明这些亚群是Map3k2调控基质细胞的潜在候选者，最终将目标锁定在簇2和簇5。簇5细胞表达高水平的CD81和CD34而没有CD，簇2细胞缺少CD81和CD34但表达CD。尽管在野生型和Map3k2-/-中簇5细胞基础Rspo1的表达相似，但DSS处理导致野生型而非Map3k2-/-细胞的Rspo1表达显著上调，表明簇5细胞可能是响应DSS损伤的依赖Map3k2调控基质细胞，并将这些细胞称为Map3k2调控的肠道基质细胞(MRISCs)。通过CD81和CD34抗体进行免疫染色显示，表达Rspo1的MRISCs确实位于结肠隐窝区域。
CD90medCD81+CD34+MRISCs通过增加R-spondin1的生成保护肠道干细胞
04MRISCs具有独特表观遗传特征并通过ROS–MAP3K2–EKR5–KLF2–R-spondin1信号轴促进ISC的生长
为了确定MRISCs的生理作用，将MRISCs与结肠类器官共培养，来自野生型和Map3k2-/-结肠的MRISC具有相似的基础生长促进作用，但是DSS处理仅在野生型MRISC中增强这种作用。通过外科手术将野生型和Map3k2-/-MRISCs异位移植到经DSS处理的小鼠结肠固有层，发现Map3k2-/-MRISCs在诱导ISC标记基因表达方面比野生型MRISCs弱得多。因此，MRISCs的保护功能主要是由MAP3K2-R-spondin1轴介导。为了在表观遗传水平上定义MRISC，进行了转座酶可及性分析(ATAC-seq)，以峰为中心的可及元素热图显示，MRISCs与基质细胞的其他亚群明显不同，一致地，Cd81和Rspo1启动子可在MRISCs中特异性获得，而在其他三类基质细胞中则不可。
利用scRNA-seq数据进行的转录因子活性分析表明，MRISCs可能受KLF2和HOXB2转录网络的调控。在Rspo1启动子中鉴定出一个Kruppel样因子(KLF)结合基序，其在MRISCs中特异可得。在MRISCs中表达的KLF家族中，DSS治疗后，只有Klf2在Map3k2缺乏结肠被下调，表明Klf2是Map3k2的关键靶点。染色质免疫沉淀(ChIP)分析表明KLF2与Rspo1启动子中假定的Klf基序结合，Klf2过表达可促进Rspo1表达。接下来搜索诱导MRISCs中Rspo1表达的上下游激动信号，发现H2O2刺激MRISCs以Map3k2依赖的方式增强了Klf2和Rspo1的表达。并发现ERK5是介导Map3k2信号并驱动Klf2和Rspo1表达的关键下游激酶。
MRISCs具有独特表观遗传特征并通过ROS–MAP3K2–EKR5–KLF2–R-spondin1信号轴促进ISC的生长
结论
总而言之，该研究确定了由基质细胞亚群组织构建的ISC微环境，并将该细胞群称为MRISCs，它们通过ROS–MAP3K2–KLF2–RSPO1轴保护结肠免受急性损伤。MRISC与最近鉴定出的参与小肠动态平衡的营养细胞不同，MRISCs在抑制肠道炎症和病理学方面潜在作用的未来研究，可能会为使用WNT调节剂或MAPK抑制剂治疗炎症性肠病和结肠炎相关的大肠癌提供线索。
参考文献
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