背景：
慢性炎性疾病如IBD是源于免疫反应失调、细胞因子/趋化因子分泌异常以及肠道屏障和微生物群的改变。在IBD中，肠道微生物群释放出肠毒素，增加肠黏膜的通透性，导致有害细菌入侵，损伤肠上皮细胞，造成肠道炎症状态。在UC患者中，NFκB在上皮细胞和粘膜巨噬细胞中被激活，从而促进一系列NFκB调节的细胞因子的分泌，包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)。由于诱发性炎症激活的复发周期，在细胞因子风暴综合征和癌症发生方面，IBD病患者更易受影响。这是由于过度活跃的NFκB依赖性细胞因子分泌导致免疫细胞过度增殖和过度组织损伤，从而导致新的癌症突变的积累。NFκB有许多调节因子，包括激酶、泛素连接酶和miRNAs等。其中一些已被确定为潜在的治疗靶点。人类基因组中仅有约1%~2%的区域编码蛋白质，而75%~90%被转录成非编码RNAs，然而似乎激活、微调或关闭NFκB活性的关键调节因子尚未被发现。长链非编码RNA(lncRNA)构成了大多数哺乳动物基因组这种狂暴转录。为了识别受NFκB直接和特异性调节的lncRNAs，我们对经TNFα处理的野生型(WT)、p65-/-和Ikkβ-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)在不同时间点进行了RNA-seq分析(图1A，B)。该筛选揭示了小鼠中一种新的、进化上保守的lncRNA，Gm及其人类同源物(loc)，这两种物质都被NFκB的p65亚基显著且特异性地激活。我们将这种未命名的lncRNA命名为NFκB相关免疫调节长链非编码RNA，NAIL。在包括UC在内的多种人类炎性疾病中，hNAIL均被上调。为了模拟Neil的功能，我们删除了小鼠近端Neil(mNAIL)启动子中两个保守的NFκB位点，并建立了一个小鼠模型(mNAILΔNFκB)，其中Neil基因对NFκB依赖性激活无反应。mNAILΔNFκB小鼠表现出NFκB靶点表达减少，因此结肠炎减少。在炎症刺激下，NAIL表达，并隔离Wip1磷酸酶，防止Wip1去磷酸化，并使活性p65和其他Wip1靶点如p38失活，这是炎症基因全面表达的必要条件。这些结果首次证明了lncRNAs可以直接调节磷酸酶对其底物的可及性，这在炎症反应中具有重要意义。
简介：
年11月25日，来自美国分子和分子生物学研究所和美国分子和分子生物学研究所VinayTergaonkar教授及其课题组在Gut(IF:19.)上发表NAIL:anevolutionarilyconservedlncRNAessentialforlicensingcoordinatedactivationofp38andNFκBincolitis的研究[1]，旨在探索在炎症刺激下，NAIL表达在炎症反应中具有重要意义。本研究有以下新发现：1.NAIL是第一个通过基因筛选鉴定的lncRNA，它的表达完全依赖于核转录因子NFκB。这种一种在以前的文献研究中没有记录的独特的自动调节。2.NAIL与NFκB形成正反馈回路信号，并且其在大肠炎中的表达增强。3.NAIL通过调节炎性细胞因子的表达和募集效应细胞至炎症部位来调节结肠炎的发展。4.NAIL同时激活p38(一种激酶)和p65(一种转录因子)。这种两种途径的直接协同激活尚未被任何其他lncRNA记录。5.NAIL使一种必需磷酸酶(Wip1)失活，该磷酸酶激活NFκB和p38信号传导，导致大肠炎全面炎症。
主要方法：
使用首次基因筛选识别NFκB特异性lncRNA，我们对p65-/-和Ikkβ-/-小鼠胚胎成纤维细胞进行了RNA-seq分析，并报告了一种进化保守lncRNA的鉴定，命名为mNAIL(小鼠)或hNAIL(人)。包括UC在内的人类炎症疾病中，hNAIL表达上调。我们培育了mNAILΔNFκB小鼠，将其中mNAIL近端启动子中两个NFκB位点的缺失破坏了其诱导作用，以研究其在结肠炎中的作用。
主要结果：
Gm(mNAIL)的识别和表征分析；一种由NFκB信号通路特异性调控的新型lncRNA
除了激活NFκB通路，肿瘤坏死因子α(TNFα)受体的参与还会导致JNK、p38和凋亡通路的激活(图1A)。由于NFκB激活在TNF信号下游的p65-/-和Ikkβ-/-MEFs中特异性受损，我们使用这些细胞来鉴定NFκB驱动的lncRNAs。识别了经TNFα刺激下野生型(WT)p65-/-和Ikkβ-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)之间差异表达的lncRNAs(图1B)。为了识别受NFκB信号直接和特异性调节的lncRNAs，我们选择了在野生型小鼠(WT)中以时间依赖性方式诱导TNFα的lncRNAs而不是在p65-/-和Ikkβ-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中。我们选择了Gm(一种在白介素-7抗转录方向表达的新型lncRNA)进行进一步的功能和机制研究(图1C)。在用TNFα刺激的野生型小鼠胚胎成纤维细胞中，Gm的表达显著上调(图1D)。然而，与野生型相比，在TNFα刺激下，p65-/-和Ikkβ-/-和Ikkγ-/-永生化小鼠胚胎成纤维细胞中的Gm表达显著减弱来自野生型、p65-/-和Ikkβ-/-的原代小鼠胚胎成纤维细胞也显示，Gm的激活是以Ikkβ依赖和p65独立调控的方式特异性发生的(图1E)。此外，在野生型永生化小鼠胚胎成纤维细胞中，还通过刺激TLR4配体脂多糖(LPS)诱导Gm表达重要的是，抗转录基因白介素-7在刺激时保持相对不变，表明p65通过Ikkβ诱导Gm的特异性。总之，这些结果表明，在TNFα和LPS等主要炎症刺激的下游，NFκB信号通路特异性激活了Gm的表达。
图1.NFκB信号通路调控的lncRNAs的识别。(A)用于识别受NFκB调节的lncRNAs的NFκB信号通路和筛选策略。交叉代表敲除小鼠胚胎成纤维细胞时相应蛋白(Ikkβ，Ikkγ，p65)的丢失。(B)在指定时间点，暴露于肿瘤坏死因子α的永生化小鼠胚胎成纤维细胞中的WT、p65-/-和Ikkβ-/-中差异表达lncRNAs的logCPM值的热图，并通过配对末端RNA测序进行分析，Gm显示为红色箭头。(C)(GmlncRNA(蓝色)遗传位点示意图。Gm由白介素-7基因抗转录方向表达(红色)。Gm启动子区的NFκB结合基序以黄色高亮序列显示。(D)RT-qPCR分析在所示的不同时间点暴露于TNFα的永生化野生型小鼠胚胎成纤维细胞中的Gm转录物水平。(E)RT-qPCR分析在指定时间过程中接受TNFα治疗的野生型(n=5)、p65-/-(n=8)和Ikkβ-/-(n=3)独立初级小鼠胚胎成纤维细胞中的Gm。P值采用Student’st检验法计算(***p0.)。(f)24份炎症和患者匹配的非炎症样本的基因表达谱。差异表达基因见热图。loc以红色箭头显示。(g)span=""箱线图显示UC患者炎症结肠组织中hNAIL(LOC)表达上调。KO，敲除；MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；WT，野生型。
mNAILΔNFκB小鼠表现出由NFκB引起的mNAIL活化丧失和炎症减弱
我们培育了mNAILΔNFκB小鼠，使用集群空间短回文的重复序列(CRISPR)-Cas9基因组编辑摘除了mNAIL上游的两个保守NFκB结合基序(图2A)。mNAILΔNFκB小鼠以正常的孟德尔比率存活出生，没有明显的表型(图2B)。通过基因分型PCR(图2C)和Sanger测序(图2D)证实了NFκB基序的缺失。三个独立的mNAILWT和mNAILΔNFκB原代小鼠胚胎成纤维细胞克隆显示，mNAIL表达在mNAILΔNFκB克隆中被消除，而白介素-7基因的表达水平在TNFα治疗后未受影响(图2E，F)。与mNAILWT小鼠胚胎成纤维细胞相比，我们还观察到mNAILΔNFκB小鼠胚胎成纤维细胞在TNFα治疗时NFκB靶点TNFα和白介素-1β表达水平下降(图2G，H)。两个独立siRNAs对mNAIL的耗竭显示NFκB靶基因表达降低(图2I，J)，p65和p38磷酸化显著降低(图2K)。由于白介素-7在胸腺、脾脏和结肠组织中高度表达，因此我们分析了mNAILWT和mNAILΔNFκB组之间在胸腺中的表达，并观察到RNA和蛋白水平无显著差异。尽管未观察到白介素-7表达(RNA和蛋白水平)的任何破坏，但我们使用siRNA法敲除了白介素-7基因，以研究白介素-7对NFκB信号传导的影响。根据TNFα的表达判断，白介素-7耗竭不影响NFκB活化。总之，这些结果表明，在Neil启动子中编辑两个保守的NFκB位点特异性地抑制了Neil对炎症刺激的诱导性，并且Neil反过来在体内调节NFκB靶基因。
图2.mNAILΔNFκB小鼠表现出NFκB活化减少和炎症。(A)使用CRISPR-Cas9编辑的mNAILlncRNA启动子靶向示意图。NFκB结合基序在mNAIL的启动子区以黄色显示。(B)使用标准方法培育所有小鼠。所有mNAIL小鼠均按正常的孟德尔比率出生，未受到激发的小鼠表现正常。(C)mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的基因型PCR结果。显示了来自mNAILWT和MnailδnfκB等位基因的PCR产物。(D)mNAILWT和mNAILΔNFκB细胞的Sanger测序结果。(E–H)mNAIL和mNAILΔNFκB小鼠胚胎成纤维细胞(n=3)在指定时间点接受TNFα治疗。使用RT-qPCR对(E)mNAIL、(F)白介素-7、(G)TNFα和(H)白介素-1β基因进行表达分析。(I–K)野生型小鼠胚胎成纤维细胞用si-对照、si-Neil#1和si-Neil#2SiRNA转染。转染48小时后，用或不用TNFα处理细胞，收获用于基因表达分析。图显示通过RT-qPCR进行的(I)mNAIL和(J)TNFα的基因表达分析。肌动蛋白作为对照。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。P值采用Student’st检验法计算(*p0.05span="";**p0.01span="";n.s表示无显著意义)。(K)使用蛋白质印迹法分析细胞裂解物中的指示蛋白。MEFs，小鼠胚胎成纤维细胞；WT，野生型。
mNAILΔNFκB小鼠显示结肠炎和结肠炎症减少
mNAILΔNFκB小鼠表现出结肠炎和结肠炎症减少，给予mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠3%硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导急性结肠炎(图3A)。mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的初始体重相似，但是，在DSS治疗中，与mNAILWT的对照小鼠相比，mNAILΔNFκB小鼠的体重减轻较小(图3A)。在DSS治疗中，与mNAILWT对照药物相比，mNAILΔNFκB小鼠的结肠缩短明显更小，疾病活动指数(DAI)更低(图3B-D)。这些结果提示mNAILΔNFκB小鼠的炎症减轻。
图3.mNAILΔNFκB小鼠对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎具有耐药性。(A)DSS计划:诱导结肠炎模型(上图)。mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的治疗如上图所示。对小鼠的体重测量值进行了8天的监测(下图)。(B和C)在第8天测量的DSS处理的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的结肠长度。(D)每日记录疾病活动指数。(E)在第8天从DSS治疗的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠中分离骨髓细胞，并对CD11b(PE)、Ly6c(BV)和Ly6g(FITC)细胞表面标志物进行染色。通过荧光激活细胞分选技术分析细胞并作为CD11b+细胞门控细胞。图显示了接受或未接受DSS治疗的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的代表性FACS数据。(F)CD11b+门控细胞进一步检测的Ly6c和Ly6g标记。(G-I)定量(E)和(F)中门控的CD11b+、CD11b+Ly6Chi+Ly6G-，CD11b+Ly6Clow+Ly6G+细胞。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差(UT：n=9；DSS：n=15)。P值采用Student’st检验法计算(*p0.05span=""；**p0.01span=""；***p0.span=""；****p0.0span=""；n.s表示无显著意义)。DSS，硫酸葡聚糖钠；FACS，荧光激活细胞分选技术；SSC，侧面散射；UT，未治疗；WT，野生型。
mNAIL表达受到骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的功能性调控
为了确定体内mNAIL表达的主要部位，我们使用全身脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症模型，解剖了mNAIL在不同细胞类型和组织(包括胸腺、肝脏、脾脏、肺和BMDM)中的反应(图4A-E)。我们在胸腺和肝脏中观察到了mNAIL的轻度诱导作用(图4A，B)，但在脾和肺组织中未观察到诱导(图4C，D)。在BMDMs中观察到了mNAIL的强烈诱导作用(图4E，F)。在mNAILΔNFκBBMDM中，我们观察到LPS激发时NFκB靶TNFα、CCL2和CXCL2的诱导效应减弱(图4G–J)。ChIP-qPCR结果显示，mNAIL的缺失导致这些众所周知的NFκB靶基因的启动子上p65的比重显著减少(图4K，L)，表明NAIL的缺失会影响DNA结合，从而影响NFκB的转录。我们观察到在BMDMs中无mNAIL时，磷酸化p65和磷酸化p38水平均显著降低(图4M)。我们未观察到无关蛋白磷酸-MKK4的任何变化，这提示了NAIL对p65和p38磷酸化的特异性作用(图4M)。至关重要的是，在DSS模型中，骨髓谱系特异性敲除(KO)p65和p38显示炎症反应减少和体重差异，与在mNAILΔNFκB小鼠中的观察结果非常相似。为了确定NAIL这一功能的分子基础，我们使用接受或不接受DSS治疗的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的结肠组织进行RNA-seq分析(图5A)。在未治疗(UT)组中只有少数基因差异表达，这再次表明，由于基因组编辑假象，mNAIL近端启动子中两个NFκB位点的缺失不会引起转录组的任何全局改变。然而，DSS治疗引起基因表达的巨大变化，在mNAILΔNFκB小鼠中大多数基因下调(图5A)。基因本体分析显示，mNAILΔNFκB结肠中大多数差异表达和下调基因均属于NFκB调控的炎症通路。为了验证RNA-seq结果，我们对NFκB靶基因进行了基因表达分析，并观察到与mNAILWT组相比，TNFα、IL1β和CCL2基因在mNAILΔNFκB小鼠结肠组织中的表达降低(图5B–E)。与基因表达结果相似，结肠组织中TNFα和IL1β蛋白水平降低(图5F，G)。与mNAILWT组相比，我们还观察到DSS治疗的mNAILΔNFκB结肠中的磷酸化p65和磷酸化p38水平降低(图5H)。
图4.mNAIL主要在髓系细胞中表达，其表达会增强NFκB的活化和炎症。(A-E)LPS(5mg/kg)腹腔注射至C57BL/6N野生型小鼠(n=6)。4小时后采集(A)胸腺、(B)肝脏、(C)脾脏和(D)肺组织，采用RT-qPCR对mNAIL基因进行表达分析。(E，F)从野生型小鼠(n=6)中分离骨髓细胞，并向骨髓源性巨噬细胞(BMDM)分化7天。使用或不使用LPS(ng/mL)处理BMDM细胞4小时。(E)图表显示通过qPCR进行的mNAIL表达分析。(F)在LPS刺激的BMDM细胞中显示了mNAIL表达的时间动力学。将数据标准化为肌动蛋白。(G-J)从mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠(n=6)中分离骨髓细胞，并向BMDM分化7天。使用或不使用LPS(ng/mL)处理BMDM细胞4小时。图中显示了通过qPCR进行的(G)mNAIL、(H)TNFα、(I)CCL2和(J)CXCL2的基因表达分析。将数据标准化为肌动蛋白。使用或不使用LPS处理(K–L)mNAILWT和mNAILΔNFκBBMDM细胞，并对p65(n=3)进行ChIP分析。图表显示了对(K)TNFα和(L)CXCL2启动子上p65占位的ChIP-qPCR分析。误差线表示三次生物复制的平均标准差P值采用Student’st检验法计算(*p0.05span=""；**p0.01span=""；***p0.span=""；****p0.0span=""；n.s表示无显著意义)。(M)蛋白质印迹法显示经LPS处理或不经LPS处理的BMDM细胞中的p65、p38和MKK4总量及磷酸化。每个复制被标记为#1、#2和#3。UT，未治疗；WT，野生型。
图5.mNAIL调节结肠炎炎症基因的表达。(A)热图显示了接受DSS治疗的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠之间差异表达的基因。首先对基因进行筛选，找出mNAILWT未治疗和DSS之间在DSS治疗中的差异基因，以鉴定DSS依赖基因。接下来，使用该基因列表鉴定使用DSS治疗的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠之间的差异表达基因。差异表达基因按2log2-倍差异标准鉴定，假发现率0.05。(b–e)在第8天(n=15)，通过rt-qpcr对接受或未接受dss治疗的span=""mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠的结肠组织中的(B)mNAIL、(C)TNFα(D)IL1β和(E)CCL2基因进行了表达分析。采用ELISA法测定结肠标本中TNFα、IL1β细胞因子(F-G)蛋白水平。误差线表示三个独立实验的平均标准差。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。P值采用Student’st检验法计算(*p0.05span=""；**p0.01span=""；***p0.span=""；****p0.0span=""；n.s表示无显著意义)。(H)分析第8天接受或不接受DSS治疗的mNAILWT和mNAILΔNFκB小鼠结肠组织中分离的总蛋白裂解物的磷酸化p65及磷酸化p38总量。肌动蛋白用于正常化。DSS，硫酸葡聚糖钠；UT，未治疗；WT，野生型。
结论及展望：
NAIL直接调控结肠炎的发生和发展，其表达与NFκB活性高度相关，是IBD病及其他炎症相关疾病的生物标志物和治疗靶点的理想候选物。
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